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          細胞蛋白質總量樣品的制備

          時間:2023-10-12 瀏覽次數:82

          簡介

          蛋白質的抽提是指破碎過程中,將生物材料在水,緩沖液或稀鹽溶液等適當溶劑中浸泡,使胞內的蛋白質等內容物釋放到溶劑中。

          與細胞總蛋白的提取實驗相似的是動物組織的總蛋白提取,它需要勻漿機或者研磨棒將組織塊分散,再加入裂解液并提取蛋白質。

           

          原理

          細胞蛋白的提取是生物學實驗中一種常見的實驗方法,是很多其他生物學實驗的前提。通過加入裂解緩沖溶液以及相應的蛋白酶抑制劑,能較好的保持細胞內生物大分子的天然狀態,在透膜劑以及超聲破碎儀的輔助下,細胞將發生破裂,內容物釋放出來。

           

          用途

          1. 蛋白免疫印跡;

          2. 蛋白免疫沉淀;

          3. 核漿分離等制備型和分析型實驗。

           

          材料與儀器

          細胞、細胞刮、裂解液、槍頭、燒杯、超聲破碎儀,離心機,EP 管,制冰機,記號筆。

           

          步驟

          一、蛋白提取

          1. 從培養箱中取出待提取的細胞,用吸引器洗掉培養基后,將培養皿置于冰上;

          2. 往培養皿中加入適量的裂解液,并加入相應量的蛋白酶抑制劑,一般來說,12 孔板加入100 μL 裂解液,6 cm 皿加入 300-400 μL 裂解液,晃動培養皿,使得裂解液流過細胞表面;

          3. 在冰上用細胞刮將細胞刮離培養皿,并收集到 1.5 mL EP 管中;

          4. 在冰上超聲破碎細胞(根據儀器的功率調節),一般超聲 10-15 下即可;

          5. 超聲好的細胞放入離心機中,12000 g,4℃,離心 15 分鐘;

          6. 離心完后,取出 EP,小心的將上清液轉移至一干凈的 EP 管中,待用。

           

          二、蛋白濃度的測定

          1. 96 孔板,5 孔,每孔加入 10 μL 0.9% NaCl,最后一孔加入 10 μL 2 mg/ml BSA 溶液,在倒數第二孔加入 10 μL BSA,用移液槍吹打混勻之后,吸出 10 μL 至倒數第三孔中,同樣操作一直至第二孔混勻后,棄 10 μL 溶液,此為標準曲線孔;

          2. 另取孔,每孔 8 μL 0.9% NaCl 溶液,再加入 2 μL 提好的蛋白溶液;

          3. 按照蛋白濃度測定試劑盒的說明配制好測定液,在上述濃度測定孔中每孔加入 200 μL 混合液,將平板放入 37℃ 生化箱中孵育 15-20 分鐘,再用酶標儀測定,做出標準曲線并計算每個蛋白樣品的濃度;

          4. 提取好的蛋白上清液加入等量的 2 x loading buffer,并在沸水中煮沸 15 分鐘;

          5. 一般細胞樣品按照 30 μg 的總上樣量計算出相應的上樣體積,記錄備用,并用于后續實驗。

           

          注意事項

          1. 有些蛋白容易降解,所以樣品需要一直放在冰上,樣品用完后短期負二十冰箱保存;

          2. 勤換槍頭,避免交叉污染;

          3. 超聲的次數和功率不能劇烈,容易使得蛋白斷裂;

          4. 檢測磷酸化蛋白,盡量添加磷酸酶抑制劑;

          5. 由于某些蛋白的特性,樣品不需要煮沸。

           

          常見問題

          1. 蛋白拖尾?

          可能是超聲太過劇烈,并且超聲太過劇烈,對于一些小體積的樣本,非常容易造成樣品飛濺,損失樣品。

          2. 蛋白濃度太低?上樣量太大?

          應按照個人經驗和不同細胞的特性,適當的調整裂解液加入的體積,并且在最后可以加入 5 x loading buffer 來變性樣品。


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